www.laboratorij.ba

Oboljenja vezivnog tkiva (CTD) su grupa autoimunih poremećaja koje karakteriše prisustvo antinuklearnih antitijela (ANA) u krvi pacijenata. ANA su specifična klasa autoantitijela koji imaju sposobnost vezivanja u uništavanja određenih struktura jedra u ćelijama [1]. Iako manje količine ovih antitijela mogu se naći kod zdrave populacije , iznenadan porasttitra je kod pacijenata sa CTD. Nisu samo ova antitijela uključena u patogenezu oboljenja, ali su baza dijagnostike i terapije CTD. Njihova detekcija sa visokom senzitivnošću i specifičnošću je od najvećeg značaja. Različite metode detekcije su u upotrebi i stalni je priliv novih tehnika da bi se olakšala dijagnostika i trepijski monitoring CTD pacijenata. U ovom članku se kratko diskutuje kako su ANA otkrivena i povezana sa CTD. Takođe daje i pregled napretka u različitim metodama detekcije ANA, buduće perspektive sa prednostima, manama i vodiče za upotrebu ovih testova.

Istorijski aspekti ANA

1941, Klemperer, Pollack i Baehr su prvi opisali sistemski lupus eritematodes (SLE) kao jednu od CTD[2]. Potom je 1948 Malcom Hargrave, Helen Richmond  i medicinski pripravnik Robert Morton zabilježili prisustvo nepoznatih ćelija u koštanoj srži pacijenata sa SLE. Ove ćelije su nazvali LE ćelije i opisali su ih kao zrele polimorfonuklearne leukocite koji su fagocitirali nuklearni materijal drugog leukocita [3]. Ovo veoma značajno otkriće postavilo je temelje istraživanja ANA. Otad, ANA je podjeljena u specifične subtipove baziran na nuklearnoj ili citoplazmatskoj komponenti koji napadaju – anti-DNA, anti-histon itd.

ANA subtipovi

Trenutno ANA je podjeljena u dvije glavne grupe:

Autoantitijela na DNA i histone

Antitijela protiv jednolančane i dvolančane DNA (dsDNA) otkrivena 1957. Značajni nivoi anti-dsDNA antitijela smatraju se potvrdnim u dijagnozi SLE. Ovo je praćeno i sa detekcijom anti-histonskim antitijelima u 1971 koja su povezana sa lijekovima inducirana SLE [4-8].

Autoantitijela na nuklearne antigene (ENA)

Pored DNA i histona, autoantitijela mogu ciljati i druge nuklearne antigene. Ovi nuklearni antigeni zovu se ENA i izvorno su  ekstrahovani su iz nukleusa sa fiziološkom otopinom [8]. Autoantitijelo na Smithov antigen (Sm) koji se smatra da je specifičan za SLE je bio prvi anti-ENA otkriven 1966 [9]. Nakon toga subtipovi ENA su ribonukleoproteini (RNP), SSA/Ro ili SSB/La, Scl-70, Jo-1 i PM1 su bili mnogo lakše identificirani [10-17]. Iako je većina ovih ENA specifični za bolest još uvijek značajno preklapanje postoji. Senzitivnost i specifičnost takođe varira u zavisnosti od tipa CTD. Lista klinički značajnih ANA sa njihovom senzitivnošću i specifičnošću identificiranja autoimunih poremećaja prikazani su u Tabeli 1 [18,19].

Tabela 1. Senzitivnost i specifičnost ANA i klinički značaj subtipova

*tačni podaci nisu dostupni

Kumar et al. Diagnostic Pathology 2009 4:1   doi:10.1186/1746-1596-4-1

U posljednjih nekoliko godina mnoga druga autoantitijela su opisana kao što su  topoizomeraza – I (Topo-I), centromera protein (CENP)-B, RNA-polimeraza I-III (RNA-pol I-III), MU, TM, Ku, Mi-2, RA33 itd. Mnoga od ovih antitijela nisu pronašli mjesto u kliničkoj praksi. Određena autoantitijela protiv citoplazme i ćelijske membrane su manje relevantna u dijagnostici [20,21].

Tehnike ANA detekcije

Prisustvo autoantitijela u serumu je jedan od kriterija za dijagnozu CTD. Tabela 2. Pored kliničke dijagnoze ANA subtipova takođe pomaže u identifikaciji specifične CTD [22]. Pored mnogih laboratorijskih testova dostupnih za ANA detekciju, indirektni imnuofluorescentni antinuklearni test (IF-ANA) i enzimski imunotest (EIA) su najčešće korišteni u praksi. Neki od njih se smatraju zastarjelim dok drugi kao protočna citometrija i nedavno otkrivena nanotehnologija koja uključuje antigene nizove su još uvijek u eksperimentalnom stadiju.

Tabela 2. Značaj pozitivnog ANA testa u CTD i nekim neautoimunim stanjima [36]

Kumar et al. Diagnostic Pathology 2009 4:1   doi:10.1186/1746-1596-4-1

IF-ANA: standardna tehnika za ANA       

Prije razvoja IF-ANA testa, LE ćelijska priprema je bila jedina metoda za dijagnozu SLE. IF-ANA je dizajnirana od George Friou  1957 [23]. Od tada je to najkorišteniji test za dijagnozu CTD. Jeftin i lak za izvođenje sa visokom senzitivnošću i specifičnošću [24]. Test detektuje prisustvo ANA u krvi pacijenta koji adheriraju na substrat formirajući određene fluorescentne uzorke koji su udruženi sa određenim autoimunim bolestima. U početku različiti substrati su isprobani kao dijelovi tkiva, deskvamirane ćelije, pileći eritrociti i HeLa ćelije, ali kasnije na dijelovima tkiva koristeći jetru štakora ili multi substrat (stomak miša , jetra i bubreg štakora ) postali su standardni substrat. 1975 Hep-2 ćelije su pronađene i povećale su senzitivnost testa. Ovo su kultivisane ćelije laringealnog skvamoznog karcinoma i dostupne su komercijalno fiksirane na stakalca. Većina laboratorija širom svijeta sada koristi Hep-2 ćelijske substrate [25].

Tačna interpretacija IF-ANA rezultata je važna i mora uvijek biti povezana sa pacijentovim simptomima i znacima. Tri parametra se analiziraju: uzorci fluorescencije, substrat i titar pozitivnog testa. Negativni IF-ANA rezultat isključuje mogućnost aktivne CTD.

Fluorescentni uzorci i intenzitet

Različiti načini bojenja daju dokaze o značajnim ANA i tipu CTD. (Tabela 3, Slika 1)

Slika 1. Dijagramski prikaz čestih nuklearnih uzoraka prikazanih fluorescentnim mikroskopom

Tabela 3. Česti IF-ANA uzorci udruženi sa specifičnim bolestima

Kumar et al. Diagnostic Pathology 2009 4:1   doi:10.1186/1746-1596-4-1

1. nuklearni uzorci: homogeni, razbacani, periferni, nuklearni, centromerni, PCNA (proliferativni ćelijski nuklearni antigen), nuklearna membrana.
2. citoplazmatski uzorci: razbacani, mitohondrijski, ribosomalni, Goldjijev aparat, lizozomalni, citoskeletni filamenti (aktin,vimentin, citokeratin).
3. mitotički uzorci: mitotičko vreteno, centrosomi, NuMA (nuklearni mitotički aparat), CENP-F (protein centromere).

Između ovih homogenih, razbacani, periferni i nuklearni uzorci se mnogo čeđće posmatraju i klinički su važniji. Sa bilo kojim od ovi fluorescentnih uzoraka intenzitet bojenja sa skalom od + do ++++ bi trebao biti zabilježen kao fluorescentni intenzitet koji je proporcionalan koncentraciji antitijela i predviđa težinu CTD

ANA substrat

Serum nekih pacijenata sa SLE može biti negativan na životinjskim substratima (bubreg miša ili jetri štakora) ali pozitivan na ljudskom substratu (Hep-2 ćelije) [26-28].obzirom na različitu senzitivnost substrata koji se koristi važno je označiti tip substrata koji se koristi u laboratoriji.

ANA titar

Direktno je proporcionalan koncentraciji antitijela i izražava se kvantitativno. Niži titar je manje značajan nego visoki titar i može se vidjeti i kod čak zdravih osoba. Postoje mnoge studije koje su određivale optimalno razrjeđenje seruma za ANA testiranje. Titar 1:160 je uzet kao signifikantan za dijgnozu CTD u većini laboratorija [29,30].

Iako je IF-ANA test u širokoj upotrebi i smatra se zlatnim standardom ipak rezultati mogu se nekad pogrešno protumačiti. Obzirom da detektuje nekoliko različitih antitijela mogu se javiti unakrsne reakcije. U 3% zdrave populacije daje lažno pozitivni rezultat. Takođe nivo ANA raste kada simptomi buknu , često bivajuće nedetektabilni kada simpromi opadaju ili je pacijent u remisiji. Na dalje svaka CTD ima specifična antitijela i ponekad je teško specificirati  ili kategorizirati autoantitijelo [31,32]. Neki uzorci , nuklearni i centromerni su manje definisani sa IF-ANA testom. Test je prvenstveno više za skrining nego za dijagnozu CTD.

EIA/ELISA

Postoje 2 tipa EIA ili ELISA metoda koje se trenutno koriste za testiranje na ANA. Jedna je generički test koji detektuje ANA široke specifičnosti , slična IF-ANA i druga je antigen specifični test koji detektuje ANA i reaguje sa autoantigenom dsDNA, SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, Sm, Sm/RNP itd.

U antigen specifičnom testu multipli antigeni su obavijeni na mikotitarskim staklima obično kombinacija SSA/Ro, SSB/La, Sm, i U1-RNP, Jo-1 and Scl70. Ovaj novi test je i visoko specifičan i senzitivan i smanjuje vrijeme skrininga velikog broja uzoraka. Test je jednostavan za izvođenje, može biti automatizovan i ne zahtjeva visoko stručne tehničare koji znaju prepoznati mikroskopske uzorke. EIA/ELISA postaje široko korišteni metod ne samo za rutinski skrining već i za detekciju specifičnih ANA. Kitovi dostupni sadrže ekstrakte tkiva koji sadrže različite nuklearne komponente ili molekule sintetizirane rekombinantnom tehnologijom. Kasnije mogu sadržavati individualne rekombinantne molekule kao SS-A/Ro, ili kombinacije molekula koji povećeva senzitivnost testa. U nedavnoj studiji izvođenje ELISA testa je upoređeno sa „zlatnim standardom“ IF-ANA testom. Serum je bio ANA pozitivan 87%-95% kada su se uporedile ELISA i IF-ANA rezultati [33]. Senzitivnost različitih ELISA je bio 69%-98% i specifičnost između 81%-98%. Ove brojke su dobijene koristeći serume koji su pozitivni sa 1:160 sa IF-ANA testom. Gornja uporedba je mnogo nića kod seruma sa IF-ANA titrom 1:40. Iako druga multicentrična Europska studija je pokazala da ELISA metode su poboljšane [34], nedavna studija Bizzaro i saradnici sugerirali su da je problem lažno pozitivnih rezultata kod ELISE jođ uvijek široko rasprostranjen [35]. ELISA

može izostaviti anti-SSA/Ro čak i kada koristi referentni serum. Ovo je vjerovatno rezultat metoda pripreme naivnih antigena. Serum koji regauje samo sa potvrđenim antigenima može takođe propustiti prisustvo antigena. ELISA takođe može propustiti pozitivni niski titar ANA kao i serum sa specifičnim ANA. Trenutno ELISA može biti dobra za skrining seruma samo sa intermedijarnim do visokim titrom. Ostaje budućim studijama da li će performanse ANA testova sa ELISA moći odgovarati onima sa fluorescentnom tehnikom [36]. 

Tehnike koje se koriste za detekciju specifičnih ANA

Detekcija antitijela protiv dsDNA

Tri tehnike su trenutno u upotrebi za detekciju anti-dsDNA antitijela

1. IF-ANA test koristi Crithidia luciliae kao substrat  (CLIF)
2. Farr test
3. ELISA dsDNA

CLIF

Aarden i saradnici 1975 su koristili IF-ANA za detekciju dsDNA antitijela koristeći hemoflagelat C. Luciliae kao substrat [37]. Organizam je blizak trypanosomi i snadbjeven sa intracelularnom organelom – kinetoplast. Kinetoplast sadrži dsDNA u visokoj koncentraciji dok ne sadrži niti jedan drugi prepoznatljivi nuklearni antigen. Test je najkorisniji u primarnoj dijagnostici SLE sa visokom specifičnošću u poređenju sa ELISA [38].

CLIF je jednostavan za izvođenje, određuje Ig klase i subklase antitijela na DNA. U dodatku, nema interferencije sa antitijelima na jednolančanu DNA [39].

Farr test

Farr test je radio-označeni test koji broji antitijela na date antigene u serumu putem precipitacije antitijelo-antigen kompleksa sa dodatkom amonijum sulfata u visokoj koncentraciji. Radio označeni antigen (dsDNA) omogućuje brzo određivanje antitijela u precipitatu. Farr test je dosta specifičan i smatra se veoma pouzdanim. Ipak, oduzima vrijeme, tehnički težak i koristi radioaktivni materijal [40].

Detekcija antitijela peotiv ENA

Gel precipitacijski testovi

Tehnike precipitacije antitijela na ENA su otkrivene i korištene kao dijagnostički alat za CTD skoro 5 decenija prije  [40]. Uglavnom su se koristile gel tehnike: dvostruka imunodifuzija (DID) ili protusmjerna imunoelektroforeza (CIE) [41,42]. CIE se pokazala u nekoliko studija da je senzitivnija od DID [35,43]. Ovi gel precipitirajući testovi imaju neka ograničenja. Nisu kvanititativni i senzitivnost na oboljenje je slabo [31].

Pasivna hemaglutinacija (PHA)

Kasnij 70-tih bio veoma popularan metod, ali je ubrzo potisnut sa EIA/ELISA i Western blottom. Analiza je bila ograničena na anti-Sm i anti-RNP antitijela. Test je visoko senzitivan, imao neke probleme sa specifičnošću [43].

Western (imuno) blot

Imunobloting se pojavio 1980 i bio je koristan u razumjevanju spektra ANA. U ovom metodu prvo se nuklearni i citoplazmatski antigeni su razdvojeni zahvaljujući njihovoj molekulskoj masi sa poliakrilamid gel elektroforezom i zatim su prebačeni na membranu ili trake. Trake sa antigenom se inkubiraju sa kontrolnim ili pacijentovim serumom. Ako su prisutni u serumu, ANA se veže za specifični antigen na traci. Nakon ponavljanog pranja  i inkubacija sa dva tipa  konjugata i hromogenim substratom, pozitivna reakcija kada se stvore bandovi na trakama.

Specifičnost antitijela je definirano sa identifikacijom pozitivnih bandova u poređenju sa pozitivnom kontrolnom trakom. U nekoliko studija, imunobloting je praktično nesenzitivan za anti-SSA/Ro [34,45]. Na dalje Western blott se smatra inadekvatnim za anti-Scl70 sa senzitivnošću od samo 25% [35]. Ponekad može biti problem sa otkrivanjem U1-RNP [46,47]. Specifičnost bolesti je slaba i u studijama na zdravoj populaciji lažno pozitivni rezultati nisu rijetki.

Dot blot

Ovo je kvalitativni test, koji koristi trake od nitroceluloze na kojima su antigeni na veći određenim mjestima. Izvori antigena su kravlji i zečiji timus  (za SSA,Sm i Scl70) ili teleća slezena i zečiji timus (za Sm/RNP). Trake se inkubiraju sa 50x razrjeđenim pacijentovim serumom i konjugatom alkalnim fosfataza proteinom A. Na kraju testne trake se boje sa 5-bromo-4-hloro-3-indolfosfat/nitroplavi tetrazolium. Pozitivne trake se oboje kao blave mrlje [48].  Dot blot test ima prednost jer zahtjeva samo 30 minuta,  može se lako izvesti i relativno je jeftiniji. Glavna mana je da bloting RNP antigena u kombinaciji sa Sm antigenom. Ovo podrazumjeva da ako obje mrlje SM i Sm/RNP su pozitivne na prisustvo Sm antitijela i ne mogu se razdvojiti od zajedničkog prisustva Sm i RNP antitijela.

Imunoblot sa trakama

Ovo je drugi kvalitativni test koji zahtjeva reaktivnost antitijela ka antigenima koji su na različitim linijama na membrani. Specifični nuklearni antigeni se nalaze na nitroceluloznim trakama na jednakoj udaljenosti. Trake se inkubiraju sa puferom, sadržeći blokirajući protein. Autoantitijela ako su prisutni u uzorku vežu se na antigene i prate se alkalnom fosfatazom konjugirana sa anti-humanim-IgG antitijelima i pojavljiju se kao plave mrlje na trakama. Takođe je lak za upotrebu i kratko traje i može se porediti sa ELISA u senzitivnosti i specifičnosti. Automatska interpretacija je takođe moguća [49].

Multipli imunotest (MIA)

Novo razvijena MIA omogućava detekciju multiplih specifičnih ANA kao različite entitete u isto vrijeme [50-53]. Pacijentov serum se inkubira u mješavine zrnaste suspenzije. Ova suspenzija sadrži polistirene mikrosfere koje su konjugirane sa različitim antigenima i nuklearnim ektraktom Hep-2 ćelija. Ako serum sadrži antitijela na bilo koji antigen ili Hep-2 nuklearni ektrakt, antitijelo će se vezati na imobilizirani antigen na 1 ili više zrnaca. Antitijelo-antigen-zrnce kompleks se zatim inkubira sa phycoerythrin konjugirani koziji anti-humani IgG i zrnasta suspenzija se zatim analizira sa imunotestom.

Multipli ANA test se smatra efikasnijim i tehnički manje zahtjevnim nego IF-ANA skrining, smanjuje lažnu pozitivnost, otklanja subjektivnost i efikasniji je nego konvencionalni ELISA [51].

Protočna citometrija

Sve popularnija sa autoantigen-obavijenim fluorescentnim zrncima. Daje kvantitativne rezultate bazirane na reaktivnosti sa mješavinom zrnaca od kojih je svaki označen sa jedinstvenom kombinacijom fluorescentnog signala i antigena. Višestruke prednosti kao simultano testiranje za prepoznavanje nekoliko antigena, automatski, isplativ i visoke senzitivnosti. Najznačajnije ograničenje ovog metoda je da daje samo jedan rezultat za svaku analizu.

Antigenski microarray

Trenutno nije u širokoj upotrebi ali može biti odličan napredak za simultano mjerenje višestruke ANA. Ovo je nanotehnologija u kojoj pre-sintetizirani antigeni su na polistirenu i inkubira se sa serumskim uzorkom, nakon toga sa peroksidazom hrena-konjugiran sa sekundarnim antitijelima i hemiluminescentnim substratom. Svjetlosni signali se bilježe pomoću fotoosjetljive kamere sa čip čitačem. Antitijela se broje sa kalibracijskom krivom [56].  Metod daje prednosti kompletne automatizacije, isplativosti i mnogo preciznije mjerenje nivoa antitijela. Rezultati su uporedivi sa onim koji se dobiju tehnikama koje se trenutno koriste u kliničkim laboratorijama [57-59].  Takođe je pogodan za otkrivanje novih autoantitijela [60].

Izbor tehnike ovisi o više faktora, da li je test za skrining ili detekciju specifičnog ANA, senzitivnost i specifičnost testa, dostupnost, isplativost, vrijeme izvođenja i vještine potrebne za izvođenje testa. Prednosti i mane za svaki od ovih testova je upoređen u tabeli 4.

Tabela 4. Osobine različitih testova za detekciju specifičnih antitijela

Kumar et al. Diagnostic Pathology 2009 4:1   doi:10.1186/1746-1596-4-1

Smijernice za detekciju ANA

Pozitivni ANA rezultat sa kliničkim nalazima je dijagnoza u slučaju suspektne CTD. Obzirom da su različite ANA udružene sa jednom ili drugom CTD, sistematski pristup se treba slijediti dok se izvode ovi testovi. Početni skrining je obično sa IF-ANA/ELISA i ako je pozitian, više specifičnih testova se provodi bazirano na kliničkim nalazima i IF-ANA obojenim uzorcima. Autoantitijelo na dsDNA je specifično za SLE i nivo je povećan tokom aktivne bolesti. U slučaju suspektne SLE ako homogeni uzorak je posmatran na IF-ANA, daljnji testovi CLIF,ELISA, blotting testovi mogu se uraditi da se potvrdi dsDNA. Slično, anti-Sm je visoko specifičan za SLE i potrebna je potvrda drugim testovima, ali je prisutan u samo 10% SLE slučajeva.

Anti-SSA/Ro antitijelo je najčešći kod Sjogren sindroma, ali se može naći i kod 30% SLE (kutani) slučajeva. Ako IF-ANA pokaže razbacane/periferne uzorke, daljnji testovi Blotting, MIA su potrebni za detekciju anti-SSA/Ro antitijela. Klinički značaj i metode detekcije za SSB/La su slične onim za anti-SSA/Ro osim da je manje čest i može indicirati manji tok bolesti. Dok prisustvo ova dva autoantitijela govori u prilog Sjogrenovog sindroma nisu toliko potrebni za dijagnozu. Anti-Scl-70 autoantitijelo nalazi se kod sklerodermije (SS) daje fine razbacane obojene uzorke na IF_ANA i može biti potvrđen sa imunodifuzijskim tehnikama i njihova detekcija takođe nije obavezna za dijagnozu.

Antinuklearna antitijela su grupa autoantitijela koji daju nuklearni obojeni uzorak. Najčešći su
 anti-PM-Scl, anti-RNA polymerase I-III i anti-U3-RNP (antifibrilarin). Takođe se viđaju kod skleroderme i polimiozitisa (PM), njihova detekcija nije praktikovana[24].

Protokol koji generalno prate kliničari, korak po korak u detekciji svih ovih autoantitijela je opisano u slici 2.

Slika 2. Algoritam za ANA testiranje (Kliknuti za veću sliku)

• ANA testiranje nije od pomoži u potvrdi dijagnoze reumatoidnog artritisa ili osteoartritisa, tako da se nebi trebao koristiti u ovakvim situacijama.
• ANA testiranje se ne preporučuje da se evaluira umor, bol u leđima ili drugi mišićnoskeletni bol osim ako je udružen sa jednim ili viđe kliničkih značajki vezanih za CTD
• ANA testiranje se obično ne treba tražiti samo jednom
• Pozitivni ANA test ne ne treba ponavljati
• Negativni test se treba ponoviti samo ako postoji jaka sumnja na CTD ili promjena u pacijentovoj bolesti što sugerira na dijagnozu koji treba revidirati.
• Pozitivni ANA test je važan samo zajedno sa kliničkom evaluacijom i u odsustvu simptoma i znakova CTD;
• Pozitivan ANA test može se vidjeti i kod zdravih osoba, praktično kod straijih ili kod velikog broja bolesti koje nisu CTD, gdje nemaju dijagnostičku i prognostičku vrijednost.

U budućnosti!

Budućnost za ANA detekciju izgleda obećavajuće.Prošao se dug put od najjednostavnijeg testa kao LE ćelijski metod da potpuno automatizovanog ELISA do nanotehnologije. Budući razvoj će nedvobeno uključivati mnogo softificirane instrumente sa ultra senzitivnom dijagnostikom, brže. Prednosti nove tehnologije kao višestruki imunotestovi i antigen microarray pružaju atraktivnu alternativu tradicionalnim ELISA, imunoblotingu i IFA tehnikama. Brzi razvoj u području kvantnih tački i drugih fluorescentnih nanopartikula će takođe donijeti benefit rutinskim laboratorijskim analizama.

Reference

1. Walravens M: Systemic diseases and the detection of nuclear and anticytoplasmic antibodies. A historical review.

Clin Rheumatol 1987, 6:9-17. PubMed Abstract | Publisher Full Text

2. Klemperer P, Pollack AD, Baehr G: Pathology of disseminated lupus erythematosus.

Arch Pathol (Chicago) 1941, 32:569-631.

3. Hargraves MM, Richmond H, Morton R: Presentation of two bone marrow elements: the 'tart' cell and the "LE' cell.

Proceedings of the Mayo Clinic 1948, 23:25-28.

4. Robbins WC, Homan HR, Deicher H, Kunkel HG: Complement fixation with cell nuclei and CNA in lupus erythematosus.

Proceedings of the Society for Experimental Biology (New York) 1957, 96:575.

5. Miescher P, Strassle R: New serological methods for detection of LE factor.

Vox Sanguinis 1957, 2:283. PubMed Abstract

6. Cepellini R, Polli E, Celeda F: A DNA reacting factor in serum of a patient with lupus erythematosus.

Proc Soc Exp Biol Med 1957, 96(3):572-574. PubMed Abstract

7. Monestier M, Kotzin BL: Antibodies to histones in systemic lupus erythematosus and drug-induced lupus syndromes.

Rheum Dis Clin North Am 1992, 18:415-436. PubMed Abstract

8. Fishbein E, Alarcon-Segovia D, Vega JM: Antibodies to histones in systemic lupus erythematosus.

Clin Exp Immunol 1979, 36:145. PubMed Abstract | PubMed Central Full Text

9. Tan EM, Kunke HG: Characteristics of a soluble nuclear antigen precipitating with sera of patients with systemic lupus erythematosus.

J Immunol 1966, 96:464. PubMed Abstract | Publisher Full Text

10. Asherson GL: Antibodies against nuclear and cytoplasmic cell constituents in systemic lupus erythematosus and other diseases.

Br J Exp Pathol 1959, 40:209. PubMed Abstract

11. Tan EM: An immunologic precipitin system between soluble nucleoprotein and serum antibody in systemic lupus erythematosus.

J Clin Invest 1967, 46:735. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text

12. Clark GM, Tomasi MTB: Characterization of a soluble cytoplasmic antigen reactive with sera from patients with systemic lupus erythematosus.

J Immunol 1969, 102:117. PubMed Abstract | Publisher Full Text

13. Scopelitis E, Biundo JJ, Alspaugh MA: Anti-SS-A antibody and other antinuclear antibodies in systemic lupus erythematosus.

Arthritis Rheum 1980, 23:287. PubMed Abstract | Publisher Full Text

14. Matticli M, Reichlin M: Heterogeneity of RNA protein antigens reactive with sera of patients with systemic lupus erythematosus. Description of a cytoplasmic nonribosomal antigen.

Arthritis Rhum 1974, 17:421. Publisher Full Text

15. Alspaugh MA, Talal N, Tan EM: Differentiation and characterization of autoantibodies and their antigens in Sjorgen's syndrome.

Arthritis Rheum 1976, 19:216. PubMed Abstract | Publisher Full Text

16. Wolfe JF, Adelstein E, Sharp GC: Antinuclear antibody with distinct specificity for polymyositis.

J Clin Invest 1977, 59:176. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text

17. Tan EM, Rodnan GP, Garcia I, Moroi Y, Fritzler MJ, Peebles C: Diversity of antinuclear antibodies in progressive systemic sclerosis.

Arhtritis Rheum 1980, 23:617. Publisher Full Text

18. Colglazier CL, Sutej PG: Laboratory testing in rheumatic diseases: a practical review.

South Med J 2005, 98:185-191. PubMed Abstract | Publisher Full Text

19. Habash-Bseiso DE, Steven HY, Glurich I, Goldberg JW: Serologic testing in connective tissue diseases.

Clin Med Res 2005, 3:190-193. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text

20. Miyawaki S, Kohmoto K, Ofuji KN: Identification and characterization of two new soluble nuclear antigens reactive with sera of patients with connective tissue disease.

Arthritis Rheum 1978, 21:803-810. PubMed Abstract | Publisher Full Text

21. Tan EM: Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology.

Adv Immunol 1989, 44:93-151. PubMed Abstract | Publisher Full Text

22. Tozzoli R, Bizzaro N, Tonutti E, Villalta D, Bassetti D, Manoni F, Piazza A, Pradella M, Rizzotti P: Guidelines for the Laboratory Use of Autoantibody Tests in the Diagnosis and Monitoring of Autoimmune Rheumatic Diseases.

Am J Clin Pathol 2002, 117:316-324. PubMed Abstract | Publisher Full Text

23. Friou CJ: Clinical application of lupus serum nucleoprotein reaction using fluorescent antibody technique.

J Clin Invest 1957, 36:890-897.

24. Kavanaugh A, Tomar R, Reveille J, Solomon DH, Homburger HA: Guidelines for Clinical Use of the Antinuclear Antibody Test and Tests for Specific Auto antibodies to Nuclear Antigens.

Arch Pathol Lab Med 2000, 124:71-81. PubMed Abstract | Publisher Full Text

25. Lightfoote MM, Chirmule N, Homburger HA, Kavanaugh A, Nakamura RM, Papisch W, Tetin SY: Quality Assurance of Laboratory Tests for Autoantibodies to Nuclear Antigens: (1) Indirect Fluorescence Assay for Microscopy and (2) Microtiter Enzyme Immunoassay Methods; Approved Guideline-Second Edition.

CLSI 2006., 26(13):

26. Cook L: New methods for detection of anti-nuclear antibodies.

Clin Immunopathol 1998, 88:211-220. Publisher Full Text

27. Saitta MR, Keene JD: Molecular biology of nuclear antigens.

Rheum Dis Clin North Am 1992, 18:283-310. PubMed Abstract

28. Evans J: Antinuclear antibody testing in systemic autoimmune disease.

Clin Chest Med 1998, 19:613-625. PubMed Abstract | Publisher Full Text

29. Ghosh P, Dwivedi S, Naik S, Agarwal V, Verma A, Aggarwal A, Misra R: Antinuclear antibodies by indirect immunofluorescence: Optimum screening dilution for diagnosis of systemic lupus erythematosus.

Indian J Med Res 2007, 126:34-38. PubMed Abstract | Publisher Full Text

30. Kiuttu J, Hartikainen A, Makitalo R: Occurrence of antinuclear antibodies in an unselected pregnancy population.

Gynecol Obstet Invest 1994, 37:160-163. PubMed Abstract

31. Feltkamp TE: Antinuclear antibody determination in a routine laboratory.

Ann Rheum Dis 1996, 55:723-727. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text

32. Greidinger E, Hoffman R:

Antinuclear Antibody Testing: Methods, Indications, and Interpretation, CE Update Course in Laboratory Medicine. 2003, 34:113-118.

33. Jaskowski TD, Schroder C, Martins TB, Mouritsen CL, Litwin CM, Hill HR: Screening for antinuclear antibodies by enzyme immunoassay.

Am J Clin Pathol 1996, 105:468-473. PubMed Abstract

34. Charles PJ, van Venrooij WJ, Maini RN, the Consensus Finding Group for Auto antibodies: The consensus workshops for the detection of auto antibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases: 1989–1992.

Clin Exp Rheum 1992, 10:507-511.

35. Bizzaro N, Tozzoli R, Tonutti E, Piazza A, Manoni F, Ghirardello A, Bassetti D, Villalta D, Pradella M, Rizzotti P: Variability between methods to determine ANA, anti-dsDNA and anti-ENA auto antibodies: a collaborative study with the biomedical industry.

J Immunol Methods 1998, 219:99-107. PubMed Abstract | Publisher Full Text

36. Mutasim DF, Adams BB: A practical guide for serologic evaluation of autoimmune connective tissue diseases.

J Am Acad Dermatol 2000, 42:159-174. PubMed Abstract | Publisher Full Text

37. Aarden LA, de-Groot ER, Feltkamp TEW: Immunology of DNA III: Crithidia luciliae, a simple substrate for the determination of anti-ds-DNA with the immunofluorescent technique.

Proc N Y Acad Sci 1975, 254:505. Publisher Full Text

38. Slater NGP, Cameron JS, Lessof MH: The Crithidia luciliae kinetoplast immunofluorescence test in systemic lupus erythematosus.

Clin Exp Immunol 1976, 25:480-486. PubMed Abstract | PubMed Central Full Text

39. Farr RS: A quantitative immunochemical measure of the primary interaction between IxBSA and antibody.

J Infect Dis 1958, 103:239-262. PubMed Abstract

40. Holman HR, Deicher HR, Kunkel HG: The LE cell and the LE serum factors.

Bull N Y Acad Med 1959, 35:409-418. PubMed Abstract | PubMed Central Full Text

41. Clark G, Reichlin M, Tomasi TB: Characterization of a soluble cytoplasmic antigen reactive with sera from patients with systemic lupus erythematosus.

J Immunol 1969, 102:107-122. PubMed Abstract | Publisher Full Text

42. Tan EM, Kunkel HG: Characteristics of a soluble nuclear antigen precipitating with sera of patients with systemic lupus erythematosus.

J Immunol 1966, 96:464-471. PubMed Abstract | Publisher Full Text

43. Siracusano A, Agelli M, Ioppolo S: Detection of antiextractable nuclear antigens in connective tissue diseases: comparison between passive haemagglutination, counterimmunoelectrophoresis and double immunodiffusion.

Ric Clin Lab 1985, 15:33-38. PubMed Abstract

44. Boire G, Lopez-Longo FJ, Lapointe S: Sera from patients with autoimmune disease recognize conformational determinants on the 60-kd Ro/SS-A protein.

Arthritis Rheum 1991, 34:722-730. PubMed Abstract | Publisher Full Text

45. Venrooij VWJ, Charles P, Maini RN: The consensus workshops for the detection of auto antibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases.

J Immunol Methods 1991, 140:181-189. PubMed Abstract | Publisher Full Text

46. Lock RJ, Unworthy DJ: Antibodies to extractable nuclear antigens. Has technological drift affected clinical interpretation?

J Clin Pathol 2001, 54:187-190. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text

47. Lerma JGG, Mendoza AZ, Ramos MJ: Evaluation of recombinant Ro/SSA, La/SSB, Sm and U1 RNP autoantigens in clinical diagnosis.

J Clin Lab Anal 1995, 9:52-58. PubMed Abstract | Publisher Full Text

48. Ermens AAM: Simple Dot-Blot Method Evaluated for Detection of Antibodies against extractable Nuclear Antigens.

Clin Chem 1997, 43:2420-2422. PubMed Abstract | Publisher Full Text

49. Damoiseaux J, Boesten K, Giesen J, Austen J, Tervaert JWC: Evaluation of a Novel Line-Blot Immunoassay for the Detection of Antibodies to Extractable Nuclear Antigens.

Ann NYA Sci 2006, 1050:340-347. Publisher Full Text

50. Copple SS, Martins TB, Masterson C, Joly E, Hill HR: Comparison of three multiplex immunoassays for detection of antibodies to extractable nuclear antibodies using clinically defined sera.

Ann N Y Acad Sci 2007, 1109:464-472. PubMed Abstract | Publisher Full Text

51. Xu M, Roberts BB, Busby BA, Jack RM, Finn LS, Emery HM, Rutledge JC: Evaluation of Multiplex Antinuclear Antibody Assay in Pediatric Patients.

Lab Med 2007, 38:671-675. Publisher Full Text

52. Smith J, Onley D, Garey C: Determination of ANA specificity using the UltraPlex platform.

Ann N Y Acad Sci 2005, 1050:286-294. PubMed Abstract | Publisher Full Text

53. Shovman O, Gilburd B, Zandman-Goddard , Yehiely A, Langevitz P, Shoenfeld Y: Multiplexed AtheNA multi-lyte immunoassay for ANA screening in autoimmune diseases.

Autoimmunity 2005, 38:105-109. PubMed Abstract | Publisher Full Text

54. Bonilla E, Francis L, Allam F, Ogrinc M, Neupane H, Phillips PE, Perl A: Immunofluorescence microscopy is superior to fluorescent beads for detection of antinuclear antibody reactivity in systemic lupus erythematosus patients.

Clinical Immunology 2007, 124:18-21. PubMed Abstract | Publisher Full Text

55. Aghajani EA, Berzon S, Sarkissian A: Clinical Value of Multiplexed Bead-Based Immunoassays for Detection of Autoantibodies to Nuclear Antigens.

Clin Vaccine Immunol 2007, 40:505-509. Publisher Full Text

56. Feng Y, Ke X, Ma R, Chen Y, Hu G, Liu F: Parallel Detection of Autoantibodies with Microarrays in Rheumatoid Diseases.

Clin Chem 2004, 50:416-422. PubMed Abstract | Publisher Full Text

57. Lane SK, Gravel JW: Clinical utility of common serum rheumatologic tests.

Am Fam Physician 2002, 65:1073-1080. PubMed Abstract

58. Medintz IL, Uyeda HT, Goldman ER, Mattoussi H: Quantum dot bioconjugates for imaging, labeling and sensing.

Nature Mat 2005, 4:435-446. Publisher Full Text

59. Kartalov EP, Zhong JF, Scherer A, Anderson WF: High-throughput multiantigen microfluidic fluorescence immunoassays.

BioTechniques 2006, 40:85-90. PubMed Abstract | Publisher Full Text

60. Robinson WH, DiGennaro C, Hueber W, Haab BB, Kamachi M, Dean EJ, Fournel S, Fong D, Genovese MC: Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses.

Nat Med 2002, 8:1-7. PubMed Abstract | Publisher Full Text

61. Guidelines and Protocols Advisory Committee

BCGuidelines.ca 2007.